摘自《廣西植物》

李辛雷,陳發(fā)棣

(南京農業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇南京210095)

摘　要:生物技術(shù)的發(fā)展為花卉植物種質(zhì)資源的研究、創(chuàng )新及新品種培育提供了更多的途徑。該文對花卉植物的離體保存、分子標記及細胞工程、基因工程在花卉植物種質(zhì)創(chuàng )新方面的研究進(jìn)展及取得的成果進(jìn)行了綜述,并對存在的問(wèn)題及今后的發(fā)展方向進(jìn)行了探討,以期為相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞:花卉植物;生物技術(shù);遺傳育種

近年來(lái),隨著(zhù)經(jīng)濟發(fā)展和生活水平提高,人們對花卉質(zhì)量的要求越來(lái)越高。傳統的育種方法逐漸表現出育種周期長(cháng)、遺傳變異有限、引入某一優(yōu)良性狀的同時(shí)可能會(huì )伴隨一些不良性狀等局限性。生物技術(shù)作為一門(mén)新興學(xué)科,為傳統育種注入了新的活力,提供了全新的思路。在花卉植物種質(zhì)資源的保存與研究上,離體保存越來(lái)越體現其優(yōu)越性,而分子標記已成為花卉植物生物技術(shù)方面最活躍、應用最多的一項技術(shù)。利用生物技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng )新可以從細胞、基因水平定向改造生物,擴大了育種范圍,提高了育種效率。

1　種質(zhì)資源保存

　　種質(zhì)保存(germplasmconservation)使個(gè)體中所含有的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性,且有高活力的通過(guò)繁殖將其遺傳性傳遞下來(lái)。離體種質(zhì)保存是將植物外植體在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行組織培養,將這些外植體貯存在各類(lèi)生長(cháng)抑制條件下,使其緩慢生長(cháng)或停止生長(cháng),以達到長(cháng)期保存的目的,而后如果需要時(shí)可迅速恢復正常生長(cháng)。相對傳統方法而言,離體保存所占空間小,基因型穩定,受外界影響小,恢復快,易于控制。離體保存包括限制生長(cháng)保存及低溫保存、超低溫保存。

1.1限制生長(cháng)保存及低溫保存限制生長(cháng)保存通常在培養基中加入生長(cháng)抑制劑如脫落酸(ABA)、矮壯素(CCC)、B9、PP333、6-BA等,或通過(guò)提高蔗糖濃度、加入甘露醇、山梨醇調節培養基的滲透壓,也有降低培養基中某些營(yíng)養物質(zhì)的濃度來(lái)保存種質(zhì),另外控制光照和降低培養環(huán)境

的氧氣含量亦有利于限制生長(cháng)保存。目前通過(guò)微繁及控制生長(cháng)技術(shù)保存種質(zhì)的常用溫度范圍有3種:常溫(15~25℃)、常低溫(15~0℃)和低溫(0~-80℃)。陳菁瑛等(1998)在切花菊的試管苗保存時(shí)發(fā)現培養基中添加10mg/LB9有利于種質(zhì)離體保存,延緩生長(cháng)作用較明顯,18個(gè)月時(shí)存活率仍達66·4%;2%甘露醇有利于離體保存,濃度升高時(shí)成活率下降;較弱的光照,菊花的光合作用減弱,有利于緩慢生長(cháng);常溫(25℃)處理全部死亡,4℃、6℃處理存活率僅10%,10℃、15℃的存活率分別達63·0%、58·7%,說(shuō)明適當降低溫度有利于提高菊花的存活率,且性狀正常。菊花植株在25~27℃培養環(huán)境中,當氧的分壓(PO2)低于50mmHg時(shí)(正常大氣中氧分壓為152.0mmHg),隨著(zhù)PO2降低,植株生長(cháng)量降低,而且對植株的進(jìn)一步生長(cháng)沒(méi)有影響(Bridgen等,1981)。史永忠等(2000)研究發(fā)現鐵皮石斛試管苗在4℃黑暗條件下可連續保存12個(gè)月,并能恢復生長(cháng),1/2MS和1/4MS培養基上的存活率高于MS。辛淑英和謝欣(1995)將由不定芽

再生的組培苗轉入16~18℃、光照1000lx和每天光照8h的低溫種質(zhì)庫中保存,結果表明附加甘露醇的MS培養基具有增加百合離體種質(zhì)存活率的作用,其中MS+甘露醇2%處理的效果最好,保存一年后的存活率高達92.9%。CPRO-DLO公司將百合活體在-2℃條件下貯存了3a,仍未喪失活力(Tuyl等,1996)。

1.2超低溫保存

超低溫(ultra-lowtemperature)通常指低于-80℃的低溫,主要是液氮(-196℃)及液氮蒸汽相,可降低甚至完全抑制其生活力及基因變異可能性,因此能夠保持生物材料的遺傳穩定性,有利于解決組織、細胞繼代培養及自然界中積累性的突變等變異。目前超低溫保存正成為長(cháng)期穩定地保存植物種質(zhì)資源的有效手段。劉燕等(2001)對18個(gè)科47種花卉種子進(jìn)行超低溫保存研究,除了兩種花卉種子進(jìn)入液氮后炸裂外,其余45種花卉種子保存后都有一定發(fā)芽率,有些保存后種子發(fā)芽率還高于保存前。結果表明,超低溫保存技術(shù)可廣泛應用于園林花卉種子保存,花卉種子自然含水量狀態(tài)即可存于液氮中,從液氮中取出后,35~40℃溫水浴化凍有較高的發(fā)

芽率。盡管超低溫保存已經(jīng)取得一定進(jìn)展,但由于需要昂貴的實(shí)驗設備,實(shí)驗的實(shí)際可操作性,物種的特性等原因,冷凍前后的遺傳穩定性及保存后的再生能力等問(wèn)題仍需解決,超低溫保存在花卉植物上的實(shí)際應用仍有一段距離。

2　分子標記應用

作為基因型易于識別的表現形式,遺傳標記(geneticmarkers)在植物種質(zhì)資源的研究和育種工作中有著(zhù)十分重要的地位。目前,應用較為廣泛的遺傳標記有形態(tài)標記(morphologicalmarkers)、細胞標記(cytologicalmarkers)、生化標記(biologicalmarkers)和分子標記(molecularmarkers)。前3種標記都是基因表達的結果,是對基因的間接反映,標

記數目有限,多態(tài)性較差,易受環(huán)境條件的影響。而DNA分子標記主要通過(guò)對供試材料DNA指紋圖譜比較分析后篩選出的特異帶進(jìn)行資源的鑒定,是DNA水平遺傳變異的直接反映。DNA分子標記能對各個(gè)發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、各個(gè)組織器官甚至細胞作檢測,不受環(huán)境與基因表達與否的限制,數量極多,遍及整個(gè)基因組,多態(tài)性高,遺傳穩定(Janssens,1995)。所以,DNA分子標記從它誕生之日起,就引起了生物科學(xué)家極大的興趣。在短暫的幾十年中,經(jīng)歷了迅猛的發(fā)展,分子標記日趨成熟。目前,DNA分子標記已成為花卉植物生物技術(shù)方面最活躍的技術(shù)之一,廣泛應用于生物遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析,種質(zhì)資源的系統演化及分類(lèi),基因的定位、分離測序及克隆,輔助育種,遺傳圖譜的構建等方面,并顯示了獨到的優(yōu)勢(Caetano,1995)。

2.1DNA分子標記在親緣關(guān)系、系統演化及分類(lèi)研究上的應用

在花卉植物的分類(lèi)、物種與品種間親緣關(guān)系及系統演化等方面研究中,應用分子標記技術(shù)進(jìn)行的系譜分析可以提供分子水平的客觀(guān)依據,比傳統方法更能反映其間的遺傳多樣性,有利于育種中親本的選配及資源的有效利用。目前,薔薇屬、菊屬、蓮屬、綠絨蒿屬、百合屬等類(lèi)群已將RAPD分子標記應用到系統分類(lèi)中。Hosoki等(1997)利用RAPD分析中國牡丹(ChineseTreepeony)栽培品種的遺傳關(guān)系,通過(guò)聚類(lèi)分析揭示中國牡丹品種可大致分為4大類(lèi),但這些類(lèi)別并非總是和葉型、花型或花色分類(lèi)相一致。Jay等(1989)成功地對粉紅康乃馨品種進(jìn)行了鑒定。Jackson等(2000)運用PCR技術(shù)分析微衛星DNA,對菊花的一些群體進(jìn)行分子水平上的研究。Barcaccia等(1997)利用RAPD、AFLP對天竺葵屬植物進(jìn)行品種鑒定以區分表現型相似的個(gè)體。陳向明等(2001)對7種花色系的35個(gè)牡丹栽培品種進(jìn)行RAPD分析,發(fā)現同一花色的不同品種間和不同花色系間都存在較大的遺傳多態(tài)性。劉青林等(1999)曾用RAPD技術(shù)對梅花親緣關(guān)系進(jìn)行了研究,結果表明梅與杏的親緣關(guān)系最近,與李較近,與山桃、毛櫻桃較遠。施蘇華等(1998)應用RAPD技術(shù)對11種金花茶進(jìn)行了種間遺傳相似性分析,研究其系統發(fā)育關(guān)系。Hagit(1994)利用DNA指紋圖譜分析玫瑰的遺傳關(guān)系。陳新露等(1995)用RAPD技術(shù)分析了6個(gè)丁香(Syringa)品種間的遺傳關(guān)系,確認了品種間的發(fā)展演化關(guān)系。戴思蘭等(1998)對菊屬26個(gè)分類(lèi)居群間的親緣關(guān)系和7個(gè)野生菊的系統發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究,從分子水平上驗證了現代栽培菊花(Dendranthemamorifolium)是以毛華菊(D.vestitum)、野菊(D.

indicum)種間天然雜交為基礎,然后紫花野菊(D.zawadski)、菊花腦(D.nankingense)等又參與雜交,再經(jīng)過(guò)人工選擇形成的栽培雜種復合體。

2.2DNA分子標記在花卉植物輔助育種上的應用

在花卉植物輔助育種中,運用DNA分子標記可以進(jìn)行早期選擇,提高選擇的準確度和育種效率,縮短育種周期。分子標記輔助育種主要應用于雜交親本的選配,遺傳轉化中目的基因的檢測,遺傳變異的檢測,遠緣及體細胞雜種快速鑒定,無(wú)性系、不育系的鑒定,雜種純度的評估等�；ㄉ�的不穩定表達是花卉植物轉基因存在的一個(gè)主要問(wèn)題,Jain等(1998)對非洲菊的研究認為,利用分子標記技術(shù)可以有效鑒定變異是否可以穩定遺傳。Kazvhisa等(1997)把葉綠體的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基(vbcl)基因和rRNA基因特殊區域的PCR擴增產(chǎn)物,用20多種限制性?xún)惹忻高M(jìn)行酶切的DNA限制性片段長(cháng)度多態(tài)性的分析,成功地鑒定百合種間雜種。Malek等(1997)找到了與月季黑斑病菌抗性基因緊密連鎖的分子標記,以便在月季抗黑斑病菌育種過(guò)程中,可以通過(guò)分子標記方法進(jìn)行輔助選擇,從而提高育種效率。王國良等(2001)使用RAPD

標記技術(shù)對45個(gè)月季芽變品種進(jìn)行鑒別,為表型性狀極為相近的切花月季品種的分子鑒定提供了可靠的技術(shù)手段。吳紅芝等(2002)根據菊花B病毒(CVB)的外殼蛋白基因序列設計、合成引物,建立了CVB快速、靈敏、準確的RT-PCR鑒定和檢測技術(shù)。

2.3DNA分子標記在花卉基因定位、分離及克隆上的應用

　　基因定位就是將具有某一表型性狀的基因定位于分子標記的連鎖圖中,實(shí)現分子連鎖圖與經(jīng)典連鎖圖的整合。在分子標記技術(shù)迅速發(fā)展的同時(shí),產(chǎn)生了基于單標記分析、區間作圖和復合區間作圖的QTL的統計模型,QTL定位研究隨之快速發(fā)展。Iuoras等(1998)利用RAPD分析來(lái)確定太陽(yáng)花中那些與分枝隱性基因相關(guān)的標記。荷蘭的植物育種與繁殖中心開(kāi)發(fā)了RAPD分子標記系統,找到了與百合鐮刀菌抗性基因連鎖的RAPD分子標記(Tuyl等,1996)。Holton等(1997)利用矮牽牛AFLP構建的連鎖圖譜發(fā)現,FLS基因(類(lèi)黃酮合成基因)和F1連鎖,而F1位點(diǎn)是控制類(lèi)黃酮合成的,表明F1是FLS的結構基因。利用連鎖圖譜還對矮牽�；ㄖ锌刂粕�素P450酶的Hf1和Hf2基因進(jìn)行了定位(Holton等,1997;蔡友銘等,2002)。Dunemann等(1999)基于北美杜鵑的連鎖圖譜進(jìn)行QTL分析,對缺綠病和花色這些數量性狀進(jìn)行了定位研究。Scovel等(1998)利用RAPD分子標記找到緊密連鎖康乃馨花型的位點(diǎn)標記,然后將RAPD標記轉換為RFLP標記,它能100%準確區分康乃馨的中國和美國群體的花型。劉志昕等(2001)已將建蘭花葉病毒運動(dòng)蛋白進(jìn)行了基因克隆并分析了基因序列,為今后的建蘭花葉病毒檢測工作奠定了基礎。張愛(ài)平等(1999)從香石竹上分離香石竹斑駁病毒,應用RT-PCR合成并擴增外殼蛋白基因cDNA。

2.4DNA分子標記在花卉基因圖譜構建上的應用

遺傳圖譜(Geneticmap)又稱(chēng)連鎖圖譜(Link-agemap),構建遺傳圖譜是遺傳學(xué)研究中一個(gè)很重

要的領(lǐng)域,是對基因組進(jìn)行系統研究的基礎,也是在分子遺傳基礎上強化育種的依據�；�因連鎖圖在花卉基礎遺傳研究中有重要的應用價(jià)值。首先,它提供了有關(guān)性狀遺傳控制的信息,尤其對那些復合變異類(lèi)型;其次,連鎖圖說(shuō)明了性狀變異間的連鎖關(guān)系;第三,對于控制性狀的基因連鎖圖可以作為路標,指示對有關(guān)基因的轉化�；ɑ苤参镞z傳圖譜的構建已經(jīng)開(kāi)展,如Holton等利用AFLP構建矮牽牛(Petunia)連鎖圖譜(蔡友銘等,2002)。Dunemann等(1999)利用239個(gè)RAPD標記,38個(gè)RFLP標記和2個(gè)微衛星標記構建了北美杜鵑(Rhododendron)的分子連鎖圖譜;Sondur等在前人工作的基礎上,直接利用RAPD標記構建了番木瓜的遺傳圖譜;Pillay等(1996)用RAPD標記研究啤酒花雜種一代的遺傳變異及分離情況,認為其分離比例符合孟德?tīng)栠z傳規律,并分析了將其用于遺傳連鎖圖譜構建的可行性。

3　種質(zhì)創(chuàng )新

生物技術(shù)深入到細胞水平、基因水平來(lái)定向地改造生物,提高了育種的目的性和可操作性。生物技術(shù)在植物上的應用,可打破種間雜交的障礙,擴展遺傳物質(zhì)交流的范圍,為種質(zhì)創(chuàng )新提供了更有利的措施,使品種改良方法現代化和高效化。

3.1細胞工程

高等植物細胞在生理上的重要特性之一就是細胞全能性(totipotency),即在適宜的條件下,一個(gè)植物細胞可形成一個(gè)完整的植株。植物細胞工程就是在植物細胞全能性的基礎上,利用植物組織和細胞培養及其它遺傳操作,對植物進(jìn)行改良,選育有優(yōu)良性狀的新品種,保存具有重要價(jià)值或瀕于滅絕的植物種類(lèi),使資源的創(chuàng )新達到一個(gè)新的水平。1902年Haberlandt提出細胞全能性概念,1958年Steward等用胡蘿卜(Daucuscarota)體細胞培養成功使其得到首次證實(shí)。

3.1.1單倍體育種　自1964年Guha等報道了從曼陀羅(Daturametel)首次成功誘導單倍體以來(lái),觀(guān)賞植物中矮牽牛(Petuniahybrid)、郁金香(Tulipagesneriana)等均已獲得了單倍體植株。單倍體育種中應用最多的是花藥培養,即誘導未成熟花粉改變正常的配子體發(fā)育途徑,轉向雄核發(fā)育,再經(jīng)胚胎發(fā)育而形成單倍體植物的方法�；ㄋ幣囵B具有選擇效率高,快速利用新的種質(zhì)資源和縮短育種周期等優(yōu)越性。Arzate等(1997)在百合花藥培養中發(fā)現:花粉接種時(shí)的發(fā)育時(shí)期比培養基更重要,單核小孢子早、中期比晚期易產(chǎn)生愈傷組織,冷處理及暗培養

有利于誘導愈傷組織。褚云霞等(2001)利用百合品種‘Pollyanna’單核期小孢子進(jìn)行花藥培養得到植株,經(jīng)染色體鑒定,有25%的單倍體存在。另外單倍體也可通過(guò)誘導遠緣雜交、異源細胞質(zhì)、未授粉子房培養等方式來(lái)實(shí)現。Watannabe(1977)利用野生菊與栽培菊花(Chrysanthemummakinoi)2x(2n=18)×(Ch.shiwogikucv.Kinokuniense)10x(2n=90)、(Ch.makinoi)2x(2n=18)×(Ch.ornatum)8x(2n=72)遠緣雜交后進(jìn)行胚拯救,分別得到染色體

數為2n=46和2n=37的雜種,被認為是孤雄生殖,前者外部形態(tài)較母本更多地相似于父本,外部形態(tài)不同于父本的變異可能是由于母本的細胞質(zhì)遺傳。

3.1.2體細胞無(wú)性系變異的利用　

組織培養再生的植株中,存在廣泛的變異,稱(chēng)之為體細胞無(wú)性系變異。體細胞無(wú)性系后代變異廣泛,穩定快,能基本保持原品種的特性,這為新品系的選育提供了優(yōu)越條件。費水章和周維燕(1994)利用菊花花蕾培養,得到了具有變異的植株。裘文達和李曙軒(1983)利用菊花花瓣組培,培育出了3個(gè)新的品種。單細胞對外界環(huán)境很敏感,一些外界因素(如射線(xiàn)、激光和離子束、冷熱處理、鹽脅迫等)很容易使其遺傳物質(zhì)發(fā)生變異,并且單細胞一旦發(fā)生無(wú)性系變異之后,細胞團、愈傷組織、植株等各個(gè)階段都會(huì )保持這一變異特性,從而保證了再生植株的變異遺傳穩定性,在較短時(shí)間內獲得有利用價(jià)值的突變體。此外,變異的細胞(植株)在不同的外界因子脅迫下,將形成不同特性的無(wú)性系。體細胞變異的利用,可以得到常規育種中不易得到的變異類(lèi)型,創(chuàng )建新的種質(zhì)資源�；ɑ苤参镉�種目標的多元性,將使體細胞變異的應用前景更為廣闊。

3.1.3幼胚拯救　

遠緣雜交可以向栽培品種導入近緣種屬植物的優(yōu)良種質(zhì),提高栽培作物的抗性和品質(zhì),擴大基因庫,實(shí)現種質(zhì)創(chuàng )新和培育新的優(yōu)良品種。但由于各物種間存在生殖隔離,不同的復雜遺傳基礎,同源性差異,雙親生理上的不協(xié)調,胚與胚乳的不親和及花器官形態(tài)、發(fā)育的差異等原因,使得遠緣雜交很難得到種子,或者雜種種子不萌發(fā),或萌發(fā)后夭亡,屬、種間雜交成功率較低。利用生物技術(shù)可以克服遠緣雜交障礙,克服受精前不親和現象可利用體細胞雜交,而胚拯救技術(shù)被認為是克服受精后障礙的有效手段。李容輝等(1992)通過(guò)對丁香雜交胚的培養發(fā)現幼胚培養能克服雜交種子的敗育現象,并且認為花葉丁香與佛手丁香雜交胚離體培養的有效時(shí)期是授粉后85~95d。百合是花卉胚拯救的模式植物,Nakajima(1940)用簡(jiǎn)單的糖溶液培養成功了Liliumspeciosum與L.auratum及L.spe-ciosum與L.japonicum雜交獲得的雜種胚。Asano

等(1977)提出百合胚拯救的基本培養基為MS培養基,并提出胚乳看護培養技術(shù)。子房切片培養與胚珠培養也是獲得遠緣雜種的有效方法之一,當胚很小時(shí)應先進(jìn)行子房橫切片培養再進(jìn)行胚珠培養。Van等(1991)取百合柱頭切割授粉后7~40d的子房進(jìn)行切片,厚度為2mm,成功地獲得了種間雜種。Van等(1990)分別利用百合和郁金香胚珠培養獲得雜種。至今在花卉上,胚拯救已經(jīng)成功地應用于鳳仙花屬、菊屬、蔥屬、鳶尾屬、郁金香屬、六出花屬、小蒼蘭屬、朱頂紅屬、馬蹄蓮屬等。

3.1.4原生質(zhì)體培養和體細胞雜交　

在植物生物技術(shù)育種中,原生質(zhì)體培養具有特殊意義,是細胞雜交和遺傳轉化的基礎。原生質(zhì)體對外界環(huán)境很敏感,一些外界因素(如射線(xiàn)、激光、離子束、冷熱處理、鹽脅迫等)也很容易使其遺傳物質(zhì)發(fā)生變異,在較短時(shí)間內獲得有利用價(jià)值的突變體。熊興耀等(1995)通過(guò)菊花莖段誘導產(chǎn)生的愈傷組織建立了細胞懸浮系,并酶解獲得了原生質(zhì)體。李名揚等(1996)等利用直接酶解花瓣愈傷組織獲得原生質(zhì)體的方法實(shí)現了菊花植株再生,Lindsay等(1997)利用酶解菊花莖尖和幼嫩葉片產(chǎn)生原生質(zhì)體的方法實(shí)現了植株再生。體細胞雜交指用雙親的體細胞原生質(zhì)體或其衍生系統進(jìn)行誘導融合,再經(jīng)培養、篩選、鑒定等步驟得到細胞雜種。原生質(zhì)體通過(guò)體細胞融合而獲得體細胞雜種,從而有效克服遠緣雜交上的障礙,擴大親本組合范圍,綜合不同物種的遺傳信息,豐富現有種質(zhì)資源。至今有50多種植物通過(guò)原生質(zhì)體融合得到的細胞雜種,以茄科、十字花科和蕓香科較多,禾本科、豆科和菊科植物也有報道。由于植物原生質(zhì)體具有再生植株的全能性,又排除了細胞壁的障礙,因此比其它類(lèi)型的外植體更容易導入外源基因。王國英和賀普超(1994)用電擊法將nptⅡ基因轉入歐白英(Solanumdulcamara)的原生質(zhì)體,獲得轉基因植株。李國梁等(1999)對青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)葉和下胚軸原生質(zhì)體進(jìn)行了遺傳轉化研究。一些性狀改良基因或抗性基因可以通過(guò)PEG轉化方法轉入到原生質(zhì)體,然后再對轉化原生質(zhì)體培養,獲得轉基因植株,以達到改良品種的目的。

3.2基因工程

植物基因工程技術(shù)指克隆一些特有性狀的基因,并通過(guò)生物、物理和化學(xué)等方法,導入到受體植物細胞,通過(guò)組織培養育出轉基因植物的生物技術(shù)。近年來(lái),基因工程技術(shù)為觀(guān)賞植物性狀改良提供了全新的思路,成為最有前途的花卉育種新技術(shù)。與傳統育種手段相比,基因工程育種具有獨特的優(yōu)勢:可以定向修飾花卉的某個(gè)或某些性狀而保留其它原有性狀;通過(guò)引入外來(lái)基因可以擴大基因庫。所以,通過(guò)基因工程完全有可能培育出一些新奇、獨特及具有各種目標性狀的品種,大大縮短育種周期,提高育種效率�；�因工程在花卉植物育種中的應用重點(diǎn)集中在花色、株型、抗性、花期等方面的改良上。Meyer等(1987)首次將源自玉米的編碼DQR的AI基因導入矮牽牛白花突變體中,產(chǎn)生了開(kāi)磚紅色花的矮牽牛。美國加州奧克蘭DNA植物技術(shù)公司研究人員Courtney-Gutterson等(1994)用T-DNA作為載體將苯基苯乙烯酮合成酶(CHS)以有義和反義方向導入開(kāi)粉紅色花的菊花品種‘Moneymaker’中,獲得了133株有義植株和83株反義植株,其中各有3株開(kāi)白花和淺粉色花,而剩余植株仍開(kāi)粉紅色花。在開(kāi)白色和淺粉色花的植株中由于cDNA與mR-NA結合,而使CHS活性降低,導致苯基苯乙烯酮前體物質(zhì)咖啡酸含量提高。白花植株通過(guò)無(wú)性繁殖仍能穩定地遺傳,但后代開(kāi)白花的植株中有一些花為粉紅色,這可能是反義RAN未能完全抑制CHS基因表達的緣故。Aida等(2000)用反義抑制法將CHS或DFR基因導入藍豬耳(Toreniahybrid),結果反義方向導入的轉化株花色均一變亮,而正義方向導入的轉化株花色不均一變亮。株形是花卉植物一個(gè)重要的形態(tài),如用于盆栽或地被用途的小菊,往往需要植株矮化、分枝性強、著(zhù)花數目多等。Zheng等(2001)將煙草光敏色素基因導入菊花品種‘Kitau’中,獲得的轉基因植物與對照相比,其株型明顯矮化,而且分枝角度要比野生型大�？赡苁怯捎诠饷羯�素合成引起GA3過(guò)量表達,從而導致莖縮短,多分枝,這與人工噴施GA3取得的效果是相似的。Dolgov等(1997)將rolC基因導入菊花品種‘WhiteSnowdon’中,獲得二個(gè)轉化系,其中一個(gè)系與對照相比,表現為叢生、矮化,并且葉多分裂。Petty等(2000)把光敏色素基因phyA導入菊花中,發(fā)現菊花的花梗變短,葉綠素增加,并延緩衰老。Yu等(2000)將DOH1基因導入石斛(Dendrobiumnobile),轉基因植株分枝性強且矮化�？剐杂�種也是花卉育種的一個(gè)重要方面。Marchant等(1998)將幾丁質(zhì)酶基因轉入現代月季中,轉基因植株黑斑病的發(fā)生率大大降低。Takatsu等(1999)將水稻幾丁質(zhì)酶基因導入菊花品種‘Yam-

abiko’中獲得了抗灰霉病(Botrytiscinera)的轉化植株。Dolgov等(1995)將Bt中的δ-內毒素基因導入再生能力很強的‘Bornholm’和‘WhiteHarri-come’菊花品種中,獲得轉化植株,在不噴施化學(xué)藥劑的情況下,植株表現出對扁虱(webtick)的抗性。Wordragen等(1993)以離體葉片為材料將Bt基因轉入到菊花品種‘Parliament’,獲得了抗蟲(chóng)植株。Kamo等(1996)將菜豆黃斑病毒外殼蛋白基因(BYMVCP)和Gus基因轉入唐菖蒲的懸浮細胞中,獲得了轉基因植株。Yepes等(1999)將編碼番茄斑萎病毒、鳳仙壞死斑病毒和花生環(huán)斑病毒外殼蛋白的基因導入菊花品種‘Polaris’、‘GoldenPola-ris’、‘Iridon’中,分別獲得了轉基因植物。在花期改良育種中,邵寒霜等(1999)克隆了調控花分生組織啟動(dòng)的相關(guān)基因—擬藍芥LFYcD-NA,然后轉化到菊花中,轉化后代有3株與對照相比其花期分別提前65d、67d和70d;另外有2株,

花期分別推遲78d和90d。Yu等(2000)用反義抑制法將DOH1基因導入石斛,獲得轉化株,其花期比對照早10d。Zheng等(2001)將PHYBI基因轉入菊花,轉基因植株LE31和LE32花芽分化比對照植株分別延遲4d和5d,而開(kāi)花分別延遲17d和20d,表明PHYBI基因主要影響花芽發(fā)育而不是影響花芽分化。

4　結束語(yǔ)

我國被稱(chēng)為“世界園林之母”,擁有豐富的花卉種質(zhì)資源,但我們對種質(zhì)資源的保存、研究與利用還遠遠不夠�；ɑ芊N質(zhì)資源是遺傳育種的前提和基礎,只有掌握了大量的育種材料,才能培育出新品種。植物生物技術(shù)使人類(lèi)對種質(zhì)資源的保護、研究和利用達到新的水平,我們必須加大保護、搜集、整理和評價(jià)工作力度,充分發(fā)掘花卉種質(zhì)資源的優(yōu)異基因,加以科學(xué)合理的開(kāi)發(fā)利用,使其為育種工作服務(wù)。同時(shí),花卉植物在長(cháng)期的演化過(guò)程中,在自然選擇和人工選擇的雙重壓力下,形成了非常豐富的變異類(lèi)型,遺傳背景較為復雜,其遺傳與生理生化特性的研究還有待深入。加強基礎性研究工作,拓展研究深度與廣度,如構建遺傳圖譜,進(jìn)行重要性狀遺傳基礎研究,重要性狀相關(guān)基因定位、分子克隆等,將對花卉遺傳改良及種質(zhì)創(chuàng )新具有深遠意義。生物技術(shù)育種是花卉育種的新技術(shù)、新領(lǐng)域、新方向,具有其獨特的優(yōu)勢。生物技術(shù)在花卉植物上的應用已經(jīng)取得了一定成果,但與農作物和其他園藝作物相比,仍有待深入。我們應抓住生物技術(shù)帶來(lái)的發(fā)展機遇,充分利用我國豐富的花卉植物種質(zhì)資源優(yōu)勢及已經(jīng)取得的研究成果,結合我國花卉育種現狀,集中力量,從基礎工作做起,尤其在我國傳統特色花卉育種上重點(diǎn)突破,加強學(xué)科交叉,借助其他學(xué)科力量,加大應用研究,逐步開(kāi)展具有本國特色的花卉育種,振興我國花卉事業(yè)。